INTRODUCCIÓN

Se estima que alrededor de un tercio de la población mundial están infectadas con Mycobacterium tuberculosis, bacilo causante de la tuberculosis; aproximadamente 8 millones de ellos enferman anualmente y cerca de dos millones mueren por la enfermedad, aún cuando se cuenta con técnicas de diagnóstico sencillas, precisas y con tratamientos eficaces.

La transmisión de los bacilos de la tuberculosis se produce casi exclusivamente por medio de núcleos suspendidos en pequeñas gotas que son expulsadas con la expectoración de las personas afectadas por tuberculosis pulmonar. Estas pequeñas gotas pueden permanecer infectantes en el aire durante bastante tiempo y pueden ser inhaladas por otras personas. La infección de los contactos es más probable cuando conviven o permanecen durante un tiempo prolongado cerca del enfermo que está expectorando bacilos y en un ambiente poco ventilado. No todas las personas infectadas se enferman, sólo una de cada diez personas aproximadamente, son las más susceptibles. La tuberculosis puede manifestarse en cualquier órgano, porque Mycobacterium tuberculosis se disemina por todo el organismo; sin embargo, la enfermedad pulmonar es la más frecuente, debido a que el bacilo necesita abundante oxígeno para multiplicarse. En los pulmones de los enfermos se pueden formar cavidades en las que se alojan grandes poblaciones de bacilos que pueden ser detectados en muestras de esputos.

El diagnóstico de certeza de tuberculosis puede hacerse en forma confiable en el laboratorio, demostrando la presencia de bacilos en una muestra de la lesión por medio de la baciloscopia (examen microscópico) o el cultivo. Para que la baciloscopia sea positiva es preciso que la muestra tenga como mínimo, entre 5.000 y 10.000 bacilos por mililitro de muestra. Este alto contenido de bacilos se encuentra en los pacientes con tuberculosis pulmonar, especialmente en aquellos con enfermedad avanzada y con lesiones cavitadas. Estos pacientes son los que transmiten los bacilos manteniendo la enfermedad en la comunidad.

La baciloscopia es la técnica de elección para el diagnóstico rápido y control del tratamiento de la tuberculosis pulmonar del adulto. Es simple, económica y eficiente para detectar los casos infecciosos, por eso es la herramienta fundamental de un programa de control de la tuberculosis. Agregando a esto, esta la coloración de Ziehl Neelsen, la cual es una técnica de tinción diferencial rápida para la identificación de microorganismos patógenos como es el caso de la Mycobacterium tuberculosis.

La coloración de Ziehl Neelsen es la técnica más apropiada para ser utilizada en todos los laboratorios de los países de América Latina. Es la recomendada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Unión Internacional Contra la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias (UICTER) por ser la que asegura resultados reproducibles con un entrenamiento sencillo y la más económica. Esta tinción está basada en el calentamiento del colorante para que este atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que el colorante ya no pueda salir de la bacteria. Por otro lado el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias.

Las bacterias que resisten la decoloración  son de color rojo y las que no, se observan de color azul, ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste.

CARACTERISTICAS MORFOLÓGICAS Y ESTRUCTURALES DE Mycobacterium tuberculosis.

Las mycobacterias en general pueden variar mucho en su morfología, desde formas cocoides pequeñas a largos filamentos, M. tuberculosis suele tener una morfología característica, bacilo delgado de forma recta o ligeramente curvada en frotis teñidos, y su tamaño suele ser de 1-4 micras de largo por 0,3-0,5 micras de ancho. Ocasionalmente, forma ramificaciones verdaderas que se observan en cultivos enriquecidos y en frotis de ganglios linfáticos gaseosos.

Son bacilos no formadores de esporas, sin flagelos ni cápsula. La estructura celular de M. tuberculosis consta de una gruesa pared, separada de la membrana celular por el espacio periplásmico, con cuatro capas. La más interna es el glicopéptido o peptidoglicano con moléculas de N-acetilglucosamina y ácido-N-glucolilmurámico (en lugar del habitual N-acetilmurámico) con cortas cadenas de alanina. Esta capa es el esqueleto de la bacteria que le da forma y rigidez. Externamente, hay otras 3 capas compuestas, una por polímeros de arabinosa y galactosa, otra formada por ácidos micólicos (que son ácidos grasos derivados) y otra superficial formada por lípidos como los sulfolípidos, el cord factor, llamado así por su aparente asociación con la forma acordonada con que se agrupan las mycobacterias virulentas, y los micósidos que son al igual que el anterior glicolípidos. No difiere del resto de las bacterias en cuanto al citoplasma y el ADN nuclear. Las mycobacterias son aerobios estrictos y no crecen en ausencia de oxígeno.

La M. tuberculosis se desarrolla de forma adecuada en medios simples que contienen una fuente de carbono, una de nitrógeno e iones de metales esenciales entre ellos hierro y magnesio. Para su cultivo, se requiere un medio más complejo que contenga una base de patata-huevo o una base de agar-suero. Los bacilos tuberculosos tienen un crecimiento muy lento incluso en condiciones óptimas y requiere de 10 a 20 días de incubación a 37ºC. Aunque la proliferación puede tener lugar a un pH que oscila entre 6 a 7.6, el pH óptimo de crecimiento es de 7.

Las mycobacterias son muy resistentes a la desecación. El medio ambiente en el que se encuentran constituye un factor muy importante para su viabilidad. Por ejemplo, cuando se exponen a la luz solar directa, los bacilos tuberculosos de los cultivos son destruidos en 2 horas, pero si estos están presentes en el esputo, pueden permanecer viables durante periodos más largos.

Las mycobacterias son más resistentes a la desinfección con productos químicos que otros microorganismos no formadores de esporas, probablemente como consecuencia de su contenido en lípidos. Son sensibles al calor húmedo y son destruidos por las temperaturas de pasteurización.

CONTAGIO, EVOLUCIÓN Y DISEMINACIÓN DE LA TUBERCULOSIS.

La tuberculosis es una enfermedad contagiosa. Al igual que el resfriado común, se propaga por el aire. Sólo las personas enfermas de tuberculosis pulmonar pueden transmitir la infección. Cuando tosen, estornudan, escupen o hablan, los sujetos infectados propulsan en el aire los gérmenes de la enfermedad, conocidos como bacilos tuberculosos. Basta con que una persona inhale unos pocos gérmenes para que contraiga la infección.

La evolución de la bacteria va de innumerables  tubérculos miliares en todos los órganos lo que constituye la llamada tuberculosis miliar o granulia. El desarrollo de una tuberculosis generalizada durante la evolución del complejo primario (generalización precoz) es un fenómeno poco frecuente. Más a menudo esta generalización ocurre cuando el complejo primario está curado (generalización tardía). En este último caso, el foco de origen de las metástasis tuberculosas se encuentra en algún otro órgano, como riñón, próstata, trompas de Falopio, etc. En la tuberculosis miliar se desarrollan nódulos del tamaño de un grano de mijo, en casi todos los órganos; predominan en pulmón, hígado, riñón, bazo y meninges. 

Las metástasis se originarían de preferencia del componente ganglionar linfático reblandecido, ya que éste tiene mayores relaciones con la circulación sanguínea. Se presenta como nódulos caseificados, que se extienden y pueden destruir grandes porciones del órgano. Pueden ulcerarse los nódulos y abrirse al exterior, directa o indirectamente. También pueden cretificarse, lo que representa una forma de curación. A veces, la tuberculosis orgánica compromete varios órganos, constituyendo la llamada tuberculosis orgánica múltiple o tuberculosis polisistémica.

PROCEDIMIENTOS A SEGUIR PARA LA OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE LESIONES PULMONARES Y EXTRAPULMONARES.

v     Muestras de lesiones pulmonares.

Para que el laboratorio pueda obtener resultados confiables no sólo es necesario que ejecute las técnicas correctamente. También necesita recibir una buena muestra, obtenida en cantidad suficiente, colocada en un envase adecuado, bien identificada, conservada y transportada. La muestra más examinada es el esputo, debido a que la tuberculosis pulmonar es la más frecuente. Sin embargo, dado que la enfermedad puede manifestarse en cualquier órgano, con menor frecuencia puede requerirse la investigación de muestras muy variadas: orina, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido ascítico, sangre, pus de cavidades abiertas, biopsias. Estas muestras de lesiones extrapulmonares deben procesarse también por cultivo.

·        Muestras de esputo:

El envase debe tener las siguientes características:

ü  Boca ancha de no menos de 50 mm de diámetro.

ü  Capacidad entre 30 y 50 ml para facilitar que el paciente pueda depositar la expectoración con facilidad dentro, sin ensuciar sus manos o las paredes del frasco y para que en el laboratorio se pueda seleccionar y tomar la partícula más adecuada, con comodidad, para realizar el extendido.

ü  Cierre hermético con tapa a rosca, para evitar derrames durante el transporte y la producción de aerosoles cuando se abre en el laboratorio. Las tapas a presión generan mayor riesgo de formación de aerosoles y salpicaduras en el momento de ser retiradas.

ü  Material plástico transparente resistente a roturas para poder observar la calidad de la muestra cuando la entrega el paciente, evitar roturas y derrames de material infeccioso y para que también pueda ser desechado.

Como la eliminación de los bacilos por el esputo no es constante, es conveniente analizar más de una muestra de cada paciente para el diagnóstico de la tuberculosis. La primera muestra puede detectar aproximadamente el 80% de los casos positivos, la segunda agrega un 15% y la tercera un 5% más.

·        Obtención espontánea del esputo:

ü  Elegir un lugar bien ventilado y que ofrezca privacidad.

ü  Entregar al paciente el envase de recolección ya rotulado con su nombre o número de identificación y el servicio que solicita, la baciloscopia.

ü  Solicitar al paciente una buena muestra de esputo, indicándole que inspire profundamente llenando sus pulmones de aire tanto como sea posible, retenga el aire un momento y expulse luego la expectoración con un esfuerzo de tos, tratando de arrastrar las secreciones del pulmón.

ü  Recoger el esputo producido dentro del envase tratando de que entre en su totalidad, sin manchar sus manos o las paredes externas del frasco.

ü  Repetir esta operación otras dos veces colocando todas las secreciones en el mismo frasco.

ü  Limpiar el exterior del envase con un pañuelo de papel y lavarse las manos con abundante agua y jabón.

·        Calidad de la muestra:

La muestra de esputo mucopurulenta, proveniente del árbol bronquial, es la que asegura mayor probabilidad de que se puedan observar bacilos.

Una buena muestra tiene aproximadamente 3 a 5ml, es generalmente espesa y mucoide. Puede ser fluida con partículas de material purulento. El color es variable (blanco, amarillento y hasta verdoso). A veces son sanguinolentas. Las secreciones nasales, faríngeas o la saliva no son buenas muestras para investigar tuberculosis, aunque es conveniente examinarlas de todas formas, porque siempre existe la posibilidad de que contengan parte de la expectoración o bacilos expulsados por la tos que hayan quedado en la boca, nariz o faringe.

v     Muestras de lesiones extrapulmonares.

Todas las muestras extrapulmonares deben cultivarse. En algunos casos porque la escasa cantidad de bacilos de la tuberculosis presentes sólo podrá ser detectada por cultivo, en otros para confirmar o descartar que la muestra contenga mycobacterias ambientales saprofitas (como en el caso de la orina que resulta con baciloscopia positiva) o, excepcionalmente patógenas. La baciloscopia de los líquidos con volumen mayor a 1 ml debe ser realizada luego de centrifugarlos 15 minutos a 3000g, y la de tejidos después de disgregar el material. Por esta razón es altamente recomendable que la baciloscopia de estas muestras sea realizada en el mismo laboratorio que cultivará la muestra.

·        Biopsias y material resecado:

La obtención de estos materiales está reservada al personal médico. En el caso de biopsia de endometrio, la muestra debe consistir preferentemente en raspado uterino tomado durante la primera fase del ciclo menstrual o en el período de ovulación.

ü  Envase: estéril.

ü  Conservantes: uno o dos mililitros de solución fisiológica o agua destilada estéril para evitar la desecación. No agregar formol porque es letal para el bacilo, la porción de la muestra reservada para el estudio histopatológico debe ser separada para ser preservada en formol al 10%.

ü  Conservación: el material debe ser enviado inmediatamente al laboratorio para su cultivo o ser conservado refrigerado y al abrigo de la luz hasta su envío.

MÉTODO DE COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN

La tinción de Ziehl Neelsen fue desarrollada inicialmente por Paul Ehrlich para poner de manifiesto la presencia de los bacilos causantes de la tuberculosis en muestras clínicas de pacientes.

Esta técnica es capaz de diferenciar los bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR).

La técnica de Z-N fuerza la penetración de la fucsina básica en la pared celular mediante la acción combinada del fenol y el calor, que aumentan la fluidez de la capa de ácidos micólicos: el calor “derrite” el componente ceroso y el fenol actúa a modo de disolvente, permitiendo el paso del colorante básico que se une a los ácidos micólicos con carga negativa. Cuando cesa la aplicación de calor y/o se elimina el exceso de fenol mediante un lavado con agua, la pared recupera su consistencia cerosa, pero las moléculas de fucsina quedan atrapadas en su espesor.

Con la coloración de Ziehl Neelsen se observan como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo fucsia, destacándose claramente contra el fondo azul.

·        Coloración:

ü  Disponer dos varillas de vidrio en forma paralela, a una distancia de aproximadamente 5 cm entre una y otra, una sobre un soporte dentro del lavabo/pileta de coloración.

ü   Filtrar la cantidad de fucsina necesaria para las tinciones a realizar en la jornada. Si el número de baciloscopia a colorear es pequeño, se puede filtrar la fucsina directamente cuando se la deposita sobre el extendido a través de un pequeño embudo con papel de filtro.

ü  Colocar sobre el soporte las láminas fijadas conservando el orden numérico con el extendido hacia arriba y manteniendo una separación de al menos 1cm entre ellas.

ü  Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina básica fenicada recién filtrada. Dispensar el colorante con suavidad, sin salpicar y sin tocar con el gotero o con el embudo los extendidos.

ü  Con la llama de un hisopo embebido en alcohol calentar suavemente por debajo de los extendidos, con movimientos de vaivén, hasta que observe que se desprenden los primeros vapores blancos. No calentar con mechero.

ü  En caso de derrame del colorante, reponer la fucsina, no dejar secar el preparado.

ü  En el término de aproximadamente cinco minutos calentar tres veces hasta emisión de vapores; esto es suficiente para que la fucsina penetre adecuadamente en el bacilo y se fije a sus lípidos. No hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y colorearse mal.

ü  Con una pinza, levantar cuidadosamente la lámina portaobjetos desde el extremo más cercano al operador. Enjuagar con abundante agua a baja presión, con un frasco o un grifo. Lavar muy suave y cuidadosamente la superficie eliminando totalmente la solución de fucsina. Girar el extendido y lavar con cuidado también la parte posterior.

ü  Inclinar el portaobjetos para eliminar el exceso de agua y así evitar diluir los reactivos que se utilizarán a continuación.

·        Decoloración:

ü  Cubrir la totalidad del extendido con solución decolorante y dejar actuar aproximadamente 3 minutos.

ü  Enjuagar con abundante agua a baja presión.

ü  Verificar que el extendido se ha decolorado (las partes más gruesas del extendido a lo sumo conservan un leve tinte rosado). Si se observan cúmulos rojos o coloración rosada intensa, volver a cubrir con solución decolorante, dejarla actuar entre uno y tres minutos y enjuagar nuevamente.

ü      Eliminar el exceso de agua inclinando el portaobjetos

·     Coloración de fondo:

ü  Cubrir todo el extendido con solución de azul de metileno.

ü  Dejar actuar durante un minuto.

ü  Enjuagar las láminas en ambas caras con agua a baja presión y limpiar parte inferior con un algodón si ha quedado coloreada.

ü  Observar si las láminas conservan la numeración clara y visible. Si no es así volver a numerarlas.

ü  Dejar secar las láminas a temperatura ambiente, apoyándolas en posición vertical en un soporte sobre un papel absorbente. No apoyar papel absorbente sobre el extendido.

BACILOSCOPIA: OBSERVACIÓN DE LOS BACILOS TUBERCULOSOS

La baciloscopia, es la técnica fundamental en toda investigación bacteriológica de la tuberculosis, en la detección de casos y control de tratamiento, con un costo bajo y de rápida ejecución.

La baciloscopia es una técnica que permite identificar al 70-80% de los casos pulmonares positivos, es decir, es muy bajo el riesgo de equivocarse al diagnosticar tuberculosis.

La baciloscopia puede ser realizada en laboratorios de cualquier complejidad, que posean un microscopio con lente de inmersión en buenas condiciones, algunos insumos de bajo costo e instalaciones simples en el laboratorio. Deben seguirse normas básicas sencillas que aseguren calidad y minimicen los riesgos, Es recomendable que el área sea exclusiva, pero no siempre es posible.

v     Lectura de extendidos coloreados por Ziehl Neelsen

ü  Ubicar cerca del microscopio todos los elementos necesarios:

-aceite de inmersión.

-pañuelos o trozos de papel suave.

-el Registro del Laboratorio.

-una lapicera.

-una caja para guardar portaobjetos.

-un frasco con xilol o con etanol a 70%.

ü  Depositar una gota de aceite de inmersión en un extremo del frotis, sin tocar el preparado con el gotero.

ü  Enfocar el extendido donde ha colocado la gota de aceite, con la lente 100x de inmersión.

ü  Observar cada campo microscópico en superficie y profundidad, moviendo permanentemente el tornillo micrométrico, antes de desplazarse al campo contiguo.

ü  Seguir un recorrido en líneas rectas, sistemático para recorrer el extendido evitando repetir la lectura de algunos campos.

ü  Observar la calidad del extendido y de la coloración. Si no fuesen buenas, repetir nuevamente la baciloscopia de esa muestra.

ü  Si se observan anormalidades, identificar las Causas.

ü  Contar el número de campos que ha leído y el número de BAAR que ha identificado.

ü  Para calcular el promedio de BAAR encontrados por campo, sumar el total de BAAR contados y dividir ese total por el número de campos observados. Cuando los bacilos se presentan agrupados, una estimación aproximada del número de bacilos presentes en el cúmulo es suficiente para calcular este promedio.

ü  Los campos leídos deben ser “campos microscópicos útiles”. Se considera campo microscópico útil a aquel en el cual se observan células bronquiales (leucocitos, células ciliadas) o fibras mucosas, que aparecen teñidos de azul.

ü  El extendido preparado tal como fue descrito permite observar 100 campos microscópicos en línea recta.

ü  Un microscopista experimentado completa la lectura de 100 campos en aproximadamente cinco minutos.

ü  Al finalizar la lectura, girar el revolver de los objetivos y retirar el portaobjetos de la platina.

ü  Comprobar el número de identificación y registrar el resultado.

ü  Antes de examinar el portaobjetos siguiente, limpiar suavemente la lente de inmersión con un trozo de pañuelo de papel absorbente. Esto evita la transferencia de material al siguiente frotis que se va a leer.

CONCLUSIÓN

La coloración de Ziehl Neelsen, recomendada por la Organización Mundial de la Salud, es el mejor método de coloración para los bacilos tubérculos, ya que estos pertenecen al genero de ácido alcohol resistente (BAAR), donde esta tinción actúa sobre la capa de peptidoglicano de la Mycobacterium tuberculosis tiñéndolas de rojo fucsia, esto gracias a las reacciones físico- químico que produce en dicha bacteria, para su diferenciación se utiliza el azul de metileno como contraste. Para la observación de los bacilos tuberculosos se emplea la baciloscopia, que es la técnica fundamental en toda investigación bacteriológica de la tuberculosis, la cual por su eficacia en cuanto a la detección de casos, control de tratamiento, bajo costo y de rápida ejecución, es utilizada a nivel mundial dando buenos resultados, y con muy pocas probabilidades de errores al diagnosticar tuberculosis.